La luz que revela lo invisible
La microscopía de fluorescencia se ha convertido en una herramienta indispensable en biología, ciencias biomédicas y ciencia de materiales. Su valor radica en una capacidad que difícilmente ofrecen otros modos de contraste de la microscopía óptica tradicional: permite localizar moléculas o estructuras específicas sobre un fondo oscuro, con una especificidad y una sensibilidad excepcionales, hasta el punto de poder revelar la presencia de una sola molécula.
¿Qué es la fluorescencia?
Cuando un material absorbe luz y vuelve a emitirla, el fenómeno suele explicarse mediante dos procesos físicos bien conocidos: la fluorescencia y la fosforescencia. La diferencia esencial está en el tiempo. En la fluorescencia, la emisión es casi simultánea a la absorción, con un retardo brevísimo —normalmente inferior a una millonésima de segundo— entre la llegada del fotón excitador y la reemisión. Cuando la emisión persiste de forma apreciable tras retirar la luz de excitación, hablamos de fosforescencia.
A nivel molecular, un fotón de excitación lleva un electrón a un estado de mayor energía. Esa configuración es inestable, y el electrón regresa a su estado fundamental liberando parte de la energía absorbida en forma de un nuevo fotón. Como en ese tránsito siempre se pierde algo de energía por vías no radiativas (sobre todo en forma de calor), el fotón emitido tiene menos energía —y por tanto mayor longitud de onda— que el fotón que provocó la excitación.
Diagrama de niveles de energía. El fotón de excitación (azul) lleva al electrón al estado excitado; parte de la energía se disipa sin emitir luz (ámbar) y el resto se reemite como fluorescencia (verde). Por eso la emisión tiene siempre menor energía y mayor longitud de onda que la excitación.
Una breve historia
El científico británico Sir George G. Stokes describió la fluorescencia en 1852 y acuñó el término al observar que el mineral fluorita emitía luz al ser iluminado con radiación ultravioleta. Stokes advirtió que la luz emitida tenía siempre una longitud de onda mayor que la de la luz de excitación. A lo largo del siglo XIX se comprobó que muchas sustancias —minerales, resinas, clorofila, vitaminas— mostraban fluorescencia bajo luz ultravioleta. Sin embargo, no fue hasta la década de 1930 cuando empezaron a emplearse colorantes fluorescentes para teñir tejidos, bacterias y patógenos, lo que impulsó el desarrollo del microscopio de fluorescencia.
El límite de Abbe
En 1873, Ernst Abbe formuló un límite teórico para la resolución óptica: ningún microscopio convencional podría distinguir detalles separados por menos de unos 0,2 micrómetros, aproximadamente la mitad de la longitud de onda de la luz. Este límite de difracción se expresa como λ/(2·AN), donde λ es la longitud de onda y AN la apertura numérica del objetivo. Durante más de un siglo se consideró infranqueable; la fluorescencia sería la clave para superarlo.
Hitos de la microscopía de fluorescencia. Línea de tiempo desde la descripción del fenómeno hasta la nanoscopía contemporánea.
Fluorocromos y autofluorescencia
Algunas muestras emiten luz por sí solas al ser irradiadas, sin necesidad de colorante; este fenómeno se denomina autofluorescencia y se aprovecha en botánica, petrología y la industria de los semiconductores. En tejidos animales y patógenos, en cambio, suele ser un inconveniente, por débil o por inespecífica.
Por ello lo habitual es recurrir a fluorocromos o fluoróforos: marcadores que se unen a estructuras concretas —a menudo con gran selectividad— y que, al ser excitados por longitudes de onda específicas, emiten luz útil. Dos propiedades definen su comportamiento:
El coeficiente de extinción, que indica la probabilidad de que la molécula absorba un fotón de la longitud de onda de excitación. Cuanto mayor, más eficiente es la absorción.
El rendimiento cuántico, la relación entre fotones emitidos y absorbidos (típicamente entre 0,1 y 1,0). Los valores inferiores a 1 reflejan la energía perdida por vías no radiativas.
Principios ópticos
Excitación, emisión y el desplazamiento de Stokes
La función básica del microscopio es doble: irradiar la muestra con una banda concreta de longitudes de onda y separar después la débil luz emitida de la intensa luz de excitación. El reto no es menor: la luz de excitación puede ser entre cientos de miles y un millón de veces más brillante que la fluorescencia. Por eso el límite de detección depende, en gran medida, de cuán oscuro sea el fondo.
Como intuyó Stokes, el espectro de emisión aparece desplazado hacia longitudes de onda mayores respecto al de excitación. Este desplazamiento de Stokes es la clave que permite separar ambas señales con filtros: cuanto mayor es, más fácil resulta la separación.
spectros de excitación y emisión. La curva de emisión (verde) es casi una imagen especular de la de excitación (azul), pero corrida hacia longitudes de onda mayores. Esa separación es la que aprovechan los filtros del microscopio.
El microscopio de epifluorescencia
La configuración dominante hoy es la epifluorescencia (iluminación por reflexión), atribuida al trabajo de Johan S. Ploem. El iluminador vertical se sitúa entre los tubos de observación y los objetivos: la luz de excitación llega a la muestra a través del propio objetivo, que actúa como condensador, y ese mismo objetivo recoge después la fluorescencia.
Camino óptico de la epifluorescencia. La luz de excitación (azul) pasa por el filtro de excitación, se refleja en el espejo dicroico y llega a la muestra a través del objetivo. La fluorescencia emitida (verde), de mayor longitud de onda, atraviesa el dicroico y el filtro de barrera hasta el ocular o el detector.
El recorrido de la luz, paso a paso:
– Una fuente potente (lámpara de mercurio o xenón, láser o LED) genera luz multiespectral.
– El filtro de excitación selecciona la banda deseada y bloquea el resto.
– El espejo dicroico, inclinado 45°, refleja las longitudes de onda cortas hacia el objetivo.
– El objetivo, haciendo de condensador, baña la muestra con luz intensa.
– La muestra emite fluorescencia de mayor longitud de onda, que el objetivo recoge y que sí atraviesa el dicroico.
– El filtro de barrera bloquea cualquier resto de excitación y deja pasar solo la fluorescencia.
– El cubo de filtros
En la práctica, el filtro de excitación, el espejo dicroico y el de barrera se integran en un único bloque óptico —el cubo de fluorescencia—. Los microscopios modernos alojan entre cuatro y seis cubos en un revólver o sistema deslizante, lo que permite cambiar de combinación según el fluoróforo.
Cubo de fluorescencia. Reúne en un solo bloque el filtro de excitación, el espejo dicroico y el filtro de barrera. Intercambiarlo basta para pasar de un fluoróforo a otro.
Atenuación, quenching y fotoblanqueo
Diversos factores reducen la intensidad de la fluorescencia. El término general para esta pérdida es atenuación (fading), que suele subdividirse en dos fenómenos:
El fotoblanqueo es la descomposición irreversible de las moléculas fluorescentes en estado excitado, normalmente por su interacción con el oxígeno molecular. Se aprovecha en técnicas como FRAP (recuperación tras fotoblanqueo) y FLIP (pérdida durante el fotoblanqueo), útiles para estudiar la movilidad de macromoléculas en células vivas.
El quenching o extinción reduce la intensidad por pérdida de energía no radiativa. Un caso particular es la transferencia de energía a una molécula vecina (la aceptora) muy próxima al fluoróforo excitado (el donante): el FRET, descrito teóricamente por Theodor Förster en 1948, base para estudiar interacciones moleculares por debajo del límite de resolución óptico.
Fuentes de luz
Como los niveles de emisión son bajos y la eficiencia de recolección rara vez supera el 30 %, se necesitan fuentes muy intensas. Las clásicas han sido las lámparas de arco de mercurio (50–200 W) y de xenón (75–150 W), que pierden eficiencia y aumentan su riesgo de rotura tras su vida útil (200–300 horas). La de mercurio concentra su energía en el ultravioleta cercano, con picos en torno a 313, 365, 435, 546 y 578 nm. Lo decisivo no es la potencia en vatios, sino la luminancia media.
En las últimas décadas se han generalizado los láseres (argón, argón-criptón) y, cada vez más, las fuentes LED, con larga vida útil, estabilidad y control rápido de la intensidad. Los láseres, por su pequeño tamaño de fuente y alta luminancia, son imprescindibles en la microscopía confocal.
Nomenclatura
Terminología de los filtros
Existen tres categorías de filtros: los de excitación (seleccionan la banda que excita al fluoróforo), los espejos dicroicos (reflejan las longitudes de onda cortas y transmiten las largas) y los de barrera o emisión (bloquean la excitación residual y dejan pasar la fluorescencia). Predominan hoy los filtros de interferencia. Abreviaturas frecuentes: LP (paso largo), SP/KP (paso corto), BP (paso de banda); en designaciones como BA515, el número indica la longitud de onda al 50 % de la transmisión máxima.
Proteínas fluorescentes: la GFP
Uno de los avances que más transformó esta técnica fue la proteína verde fluorescente (GFP). Osamu Shimomura la aisló en 1962 de la medusa Aequorea victoria, observando que brillaba en verde bajo luz ultravioleta. Martin Chalfie demostró después su valor como marcador genético al expresarla en el gusano transparente Caenorhabditis elegans, y Roger Y. Tsien esclareció su mecanismo y amplió la paleta de colores (mCherry, mOrange, mCitrine…). Los tres recibieron el Premio Nobel de Química de 2008.
Al poder codificarse genéticamente y fusionarse con casi cualquier proteína de interés, la GFP permite observar en células vivas procesos antes invisibles. Con marcadores de distintos colores se pueden seguir, además, varios procesos a la vez.
Microscopía confocal
El principio confocal fue patentado por Marvin Minsky en 1957, aunque la tecnología de la época no permitía aprovecharlo. A diferencia del campo amplio, que ilumina toda la muestra a la vez, el microscopio confocal usa iluminación puntual y un diafragma (pinhole) en un plano conjugado frente al detector para eliminar la luz fuera de foco. El resultado son imágenes mucho más nítidas y “secciones ópticas” que reconstruyen la muestra en 3D. El láser, el ordenador y la microelectrónica lo convirtieron en los años ochenta en una técnica de uso generalizado.
La nanoscopía
Más allá del límite de difracción
Durante más de un siglo, el límite de Abbe marcó la frontera de lo observable con luz. A comienzos del siglo XXI, varias técnicas basadas en fluorescencia lo superaron, dando lugar a la microscopía de superresolución. El Premio Nobel de Química de 2014 reconoció estos avances, otorgándose a Eric Betzig, Stefan W. Hell y William E. Moerner.
STED (deplexión por emisión estimulada), de Hell hacia el año 2000, emplea dos haces láser: uno excita los fluoróforos y otro “apaga” la fluorescencia salvo en un volumen nanométrico, que se barre punto a punto.
PALM (microscopía de localización fotoactivada), de Betzig y Hess en 2006, y las técnicas de localización de molécula única reconstruyen la imagen activando y localizando fluoróforos individuales de forma sucesiva.
Del fenómeno a la frontera
El microscopio de fluorescencia moderno combina óptica de alto rendimiento, control informatizado y adquisición digital de imágenes, superando con creces la simple observación a ojo. El control automatizado del enfoque, la platina, los obturadores, los filtros y los detectores hace posibles experimentos impensables con los instrumentos mecánicos. Gracias a la GFP, al confocal y a la nanoscopía, el rango de la microscopía óptica se extiende hoy desde una sola molécula hasta el organismo completo.
Referencias
The Nobel Prize in Chemistry 2008, «for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP». NobelPrize.org — nobelprize.org/prizes/chemistry/2008
The Nobel Prize in Chemistry 2014, «for the development of super-resolved fluorescence microscopy». NobelPrize.org — nobelprize.org/prizes/chemistry/2014
Möckl, L., Lamb, D. C. & Bräuchle, C. (2014). «Super-resolved Fluorescence Microscopy…». Angew. Chem. Int. Ed. 53, 13972–13977 — doi.org/10.1002/anie.201410265
Chalfie, M. et al. (1994). «Green fluorescent protein as a marker for gene expression». Science 263, 802–805.
Principio confocal y patente de Marvin Minsky (1957). Confocal microscopy, Wikipedia — en.wikipedia.org/wiki/Confocal_microscopy
Förster, T. (1948). Teoría de la transferencia de energía por resonancia (FRET), Ann. Phys.
